Identyfikacja Francisella tularensis techniką real - time PCR z wykorzystaniem sond hybrydyzujących zaprojektowanych dla fragmentów sekwencji genów fopA i tul4
[Real time PCR hybridization for the rapid and specific identification of Francisella tularensis]

Streszczenie.

Badano przydatność zaprojektowanych starterów FopA F/R, Tul4 F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2, Tul4 S1/S2 dla genów fopA i tul4 do wykrywania F. tularensis. W badaniach, w których użyto 50 szczepów F. tularensis uzyskano wyniki dodatnie. Swoistość reakcji wykazano badając szczepy bakterii non-Francisella tularensis. Przy użyciu starterów FopA F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2 zaprojektowanych dla genów fopA dodatnie wyniki amplifikacji uzyskano ze wszystkimi badanymi szczepami F. tularensis. Identyczne wyniki otrzymano w reakcji real - time PCR z zastosowaniem starterów Tul4 F/R i sond hybrydyzujących Tul4 S1/S2 zaprojektowanych dla genu tul4. Swoiste produkty reakcji amplifikacji pojawiły się między 16 a 18 cyklem reakcji. Badania z użyciem starterów i sond hybrydyzujących zaprojektowanych dla genu fopA wykazały, że charakterystyczna temperatura topnienia produktów wynosiła 61°C, a dla genu tul4 60°C. Przy użyciu starterów Tul4 F/R i sond hybrydyzujących Tul4 S1/S2 czułość oznaczeń wynosiła 10 fg/μl, a przy użyciu starterów FopA F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2 1 fg/μl.

Abstract.

Tularemia is highly infectious and fatal zoonotic disease caused by Gram negative bacteria Francisella tularensis. The necessity to undergo medical treatment in early phase of illness in humans and possibility of making use of bacterial aerosol by terrorists in an attack create an urgent need to implement a rapid and effective method which enables to identify the agent. In our study two primers FopA F/R and hybridization probes FopA S1/S2 designed from fopA gene sequence, were tested for
their potential applicability to identify F. tularensis. In this research 50 strains of F. tularensis were used and the test gave positive results. Reaction specificity was confirmed by using of non - Francisella tularensis bacterial species. The results obtained in the real-time PCR reaction with primers Tul4 F/R and hybridization probes Tul4 S1/S2, designed from tul4 gene, were comparable to the results from previous experiment with fopA - primers set. Investigation of fopA and tul4 primers and hybridization probes properties revealed characteristic Tm (melting temperature) value of the products - 61ºC
and 60ºC, respectively. Detection sensitivity was remarkably higher when fopA primers set was used
1 fg/μl, and for tul4 primers set, minimal detectable concentration is 10 fg/μl.